Compter les cellules peut s’avérer utile pour faire un suivi de population mise en culture, pour un test nécessitant une concentration précise.
Cela concerne les unicellulaires (levures, euglènes, chlorelles, paramécies…).
Attention, les eubactéries sont trop petites pour être aisément dénombrer dans une lame de numération. On utilise alors une technique de comptage de colonies ou un spectrophotomètre ou un turbidimètre.
Comptage de cellules grâce à une lame de numération
Plusieurs types de lames de numération sont disponibles et simples à utiliser dont la lame Kova et les cellules de Malassez.
Dans tous les cas, n’oubliez pas de faire plusieurs comptages dans les mêmes conditions afin d’obtenir des moyennes.
Si les cellules sont très nombreuses :
- Pensez à diluer vos solutions et à tenir compte du facteur de dilution dans vos calculs.
- Vous pouvez dénombrer non pas chaque petit carré mais un nombre statistique. Pour cela, pas question de choisir les carrés qui vous plaisent ! Par exemple, prenez systématiquement les petits carrés qui forment les 2 diagonales de votre grand carré.
- Utilisez Python pour automatiser le comptage.
Conseils :
- prenez en photo ce que vous voyez au microscope et faîtes le comptage ultérieurement (possibilité de revenir dessus, de faire faire le comptage à plusieurs personnes, utiliser Mesurim).
- Vous pouvez aussi si vous avez un très grand nombre de comptages à réaliser, utiliser Python pour l’automatiser. Pour cela, il faut un bon contraste de couleurs qui peut donc nécessiter un traitement préalable des photos numériques.
Lame Kova
Elle convient pour des levures par exemple. C’est une plaque jetable qui comprend 10 cupules quadrillées. Elle permet donc de réaliser 10 comptages.
Chaque cupule est un petit volume précis. Elle a une encoche où la solution doit être versée (côté en biseau).
Agitez au préalable votre solution. Prélevez au milieu de la solution (donc ni au fond, ni sur les parois, ni en surface).
Introduisez la solution dans la cupule non utilisée (non barrée au marqueur) en faisant attention à ne pas déborder.
Au microscope, faîtes la mise au point sur la partie quadrillée de la lame Kova. La grille comportant 9 grands carrés, chacun découpé en 9 petits carrés : 9 grands carrés contiennent 1 μL de liquide, 1 grand carré (formé de 9 petits carrés) contient 0,1 μL et 1 petit carré contient 0.01 μL.
Dénombrez les cellules qui sont à cheval uniquement sur deux des côtés (toujours les mêmes, par exemple en haut et à droite).
A la fin du comptage, barrez au marqueur la cupule dont vous vous êtes servi pour le comptage.
Si les 10 cupules sont barrées, jetez la lame Kova.
Cellule de Malassez
La gamme de concentration pour ce type de comptage se situe entre 250 000 et 2 500 000 cellules/ml. La concentration optimale lue avec cette méthode est de 1 million de cellules/ml.
Détermination de la concentration de cellules
Il faut au préalable constituer un témoin : gamme de concentrations choisies par l’expérimentateur. Cela permet d’étalonner la mesure pour ensuite comparer le résultat obtenu à partir d’une solution inconnue.
Utilisation d’un spectrophotomètre
Adapté pour les petites cellules : levures, chlorelles, les eubactéries par exemple.
Réalisez au préalable un enregistrement sur l’ensemble des longueurs d’onde possible pour définir la longueur d’onde adaptée à vos solutions.
Mesurez les absorbances pour votre gamme de concentrations étalon puis construisez la courbe étalon. On admet qu’on applique la loi de Beer-Lambert qui relie l’absorbance à la concentration.
Mesurez ensuite l’absorbance de la solution inconnue et à l’aide de la courbe étalon, déterminez la concentration en cellules.
Utilisation d’un turbidimètre en ExAO
Même principe que pour le spectrophotomètre. A utiliser pour des cellules plus grandes ou de tailles hétérogènes (mélange…) par exemple ou pour suivre la biomasse.
La mesure se fait souvent vers 600 nm ou dans les infra-rouges (850 à 950 nm).
Exemple pour E. coli sur le site de JF Perrin
Compter des colonies bactériennes
Site de JF Perrin, professeur agrégé en biochimie